這項(xiàng)研究的概況如圖1a所示。為了用iMPAQT系統(tǒng)描述癌癥惡性進(jìn)展過程中代謝變化的整體情況，研究團(tuán)隊(duì)首先建立了一個惡性轉(zhuǎn)化模型,用編碼人端粒酶催化成分(hTERT)和c-Myc的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染正常人二倍體成纖維細(xì)胞(TIG-3),將在三維（3-D）培養(yǎng)基中生長的TSM克隆在2-D培養(yǎng)基中擴(kuò)增以獲得AIG（錨定非依賴性生長）-1、AIG-2和AIG-3細(xì)胞，TSM到AIG-3的惡性進(jìn)展與c-Myc表達(dá)增加有關(guān)（圖1e-f）。

將iMPAQT系統(tǒng)應(yīng)用于TSM以及AIG-1、-2和-3克隆，以綜合測定342種代謝酶的豐度。與TSM細(xì)胞相比，AIG-3細(xì)胞中某些糖酵解酶的數(shù)量增加，包括己糖激酶2(HK2)、烯醇化酶1(ENO1)和乳酸脫氫酶A(LDHA)，葡萄糖攝取量也增加(圖2a)。這些結(jié)果表明，Warburg效應(yīng)在AIG-3細(xì)胞中比在TSM細(xì)胞中更為明顯。基因本體(GO)富集分析表明，與TSM細(xì)胞相比，AIG-3細(xì)胞中受影響最大的生物學(xué)過程是核酸生物合成。因此，與TSM細(xì)胞相比，AIG-3細(xì)胞中核苷酸生物合成途徑(從頭合成和回補(bǔ)途徑)中的大多數(shù)酶，包括代謝谷氨酰胺的PPAT的含量都協(xié)同增加，而谷氨酰胺逆轉(zhuǎn)途徑的限速酶GLS1的表達(dá)在AIG-3細(xì)胞中下調(diào)(圖2c，d)。為了證實(shí)在蛋白質(zhì)組水平上觀察到的這些葡萄糖代謝的變化，用[13C6]葡萄糖(圖2e)進(jìn)行了大量的同位素分析，發(fā)現(xiàn)AIG-3細(xì)胞的13C標(biāo)記效率和檸檬酸、天冬氨酸和谷氨酸的代謝物池大小都明顯高于TSM細(xì)胞(圖2f-h)。

為了證實(shí)在蛋白質(zhì)組水平上觀察到的谷氨酰胺代謝的變化，用[13C5/15N2]谷氨酰胺以及TSM和AIG-3細(xì)胞進(jìn)行了大量的同位素分析(圖3a)，隨后評估了每個反應(yīng)在標(biāo)記開始后的早期(0.25小時)和后期(6小時和24小時)的標(biāo)記效率。雖然在TSM或AIG-3細(xì)胞中沒有檢測到IMP、AMP、GMP或UMP的13C組分，但在標(biāo)記開始后的6和24小時，AIG-3細(xì)胞中15N進(jìn)入核苷酸生物合成途徑的IMP(圖3f)、AMP(圖3g)、GMP(圖3h)和UMP(圖3i)的摻入量都顯著高于TSM細(xì)胞。在AIG-3細(xì)胞中，IMP對氮的標(biāo)記效率不僅在M+1和M+2組分增加，而且在M+3組分也有同樣效果(圖3f)，這表明來自[15N]谷氨酰胺的[15N]天冬氨酸也參與了這種標(biāo)記(圖3e)。

 

在含有人體血漿生理濃度氨基酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天后，用0.6 mM [13C5/15N2]谷氨酰胺標(biāo)記TSM和AIG-3細(xì)胞，AIG-3細(xì)胞對AMP和GMP的15N標(biāo)記效率顯著高于TSM細(xì)胞。在標(biāo)記后0.25h基本上未檢測到15N核酸代謝物，這表明在早期由GLS1介導(dǎo)的谷氨酰胺回補(bǔ)反應(yīng)主要負(fù)責(zé)α-KG和富馬酸的產(chǎn)生。標(biāo)記6h或24h后兩種細(xì)胞中α-KG和富馬酸鹽的13C標(biāo)記效率沒有差異（圖3j-k），表明在該時間點(diǎn)這些代謝物反映了源自GLS1和PPAT依賴途徑的總和。與TSM細(xì)胞相比，AIG-3細(xì)胞在0.25h時α-KG和富馬酸標(biāo)記效率顯著降低（圖3j-k），表明AIG-3細(xì)胞中GLS1活性降低。綜上，蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)數(shù)據(jù)一致表明，在實(shí)驗(yàn)癌細(xì)胞模型惡性轉(zhuǎn)化過程中，谷氨酰胺的命運(yùn)基本上從TCA循環(huán)轉(zhuǎn)移到核苷酸生物合成途徑。

 

PPAT-GLS1平衡決定谷氨酰胺的命運(yùn)

在惡性轉(zhuǎn)化過程中，PPAT和GLS1的表達(dá)分別升高和降低，導(dǎo)致PPAT/GLS1比值升高。為了研究這兩種酶之間的平衡對細(xì)胞增殖是否具有確定性，研究了GLS1在AIG-3細(xì)胞中過表達(dá)的影響(圖4a)。以缺乏酶活性的突變型(S286A)的GLS1作為對照，在[13C5/15N2]中,強(qiáng)制表達(dá)GLS1導(dǎo)致α-KG標(biāo)記率增加，而IMP（圖4b）、AMP、GMP、谷氨酸和天冬氨酸標(biāo)記率降低。AIG-3細(xì)胞在2-D（圖4c）或3-D（圖4d）培養(yǎng)基中的增殖速率也由于GLS1過表達(dá)而顯著降低。且用GLS1抑制劑CB-839處理可逆轉(zhuǎn)GLS1過表達(dá)并抑制AIG-3細(xì)胞增殖（圖4c）。總的來說，GLS1的過度活化會抑制腫瘤生長。另外，分析了短發(fā)夾RNA（shRNA）介導(dǎo)的RNA干擾對AIG-3細(xì)胞PPAT耗竭的影響（圖4g），通過實(shí)驗(yàn)證明PPAT活性降低會抑制腫瘤生長，GLS1和PPAT之間的平衡控制著谷氨酰胺衍生的碳和氮代謝從而調(diào)控細(xì)胞增殖和腫瘤生長。

PPAT作為治療小細(xì)胞肺癌的新靶點(diǎn)

通過觀察發(fā)現(xiàn)PPAT的表達(dá)與神經(jīng)內(nèi)分泌癌的不良預(yù)后顯著相關(guān)，因此研究調(diào)查了這種表達(dá)是否也與小細(xì)胞肺癌(SCLC)的預(yù)后有關(guān)。小細(xì)胞肺癌患者的RNA測序數(shù)據(jù)顯示，PPAT在腫瘤中的表達(dá)高于正常組織，而GLS1在腫瘤中的表達(dá)低于正常組織(圖5a)，PPAT高表達(dá)的個體的預(yù)后明顯差于低表達(dá)的個體(圖5b)，作為嘧啶合成限速酶的UMP合成酶(UMPS)(圖5d)和GLS1(圖5e)的表達(dá)似乎都與小細(xì)胞肺癌患者的預(yù)后無關(guān)。

 

PPAT的缺失抑制了所有三種細(xì)胞系的錨定依賴性生長(圖5f-k)，而在SBC-3細(xì)胞中，這種作用被PPAT以一種抵抗shRNA介導(dǎo)的擊倒的方式強(qiáng)制表達(dá)而逆轉(zhuǎn)(圖5j，k)。GLS1的過表達(dá)也抑制了SBC-3細(xì)胞的非錨定生長(圖5l，m)?？傊?，PPAT的表達(dá)與小細(xì)胞肺癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)，并且PPAT的缺失抑制了SCLC細(xì)胞系的貼壁性生長，揭示PPAT可能是小細(xì)胞肺癌的一個有前途的治療靶點(diǎn)。

該研究確定了控制谷氨酰胺代謝命運(yùn)的關(guān)鍵因素，以及不同器官腫瘤對這些因素的依賴性。該發(fā)現(xiàn)為探索不同的癌癥治療方案提供了基礎(chǔ)。